Wokół nas jest wielu niedocenianych bohaterów, którzy wydają się zwyczajni, ale w rzeczywistości po cichu wiele dla nas wnoszą. Proteinaza K jest „niedocenianym bohaterem” w branży diagnostyki molekularnej, choć w porównaniu z „wielkimi i potężnymi” przedstawicielami branży, proteinaza K jest tak mało znana, że od dawna nie docenialiśmy jej znaczenia. Wraz z wybuchem epidemii koronawirusa, popyt na proteinazę K gwałtownie wzrósł, a jej podaż w kraju i za granicą znacznie odbiega od zapotrzebowania. Wszyscy nagle zdali sobie sprawę, jak ważna jest proteinaza K.
Do czego służy proteinaza K?
Proteinaza K jest serynową proteazą o aktywności enzymu proteolitycznego i może utrzymywać aktywność w szerokim zakresie środowisk (pH (4-12,5), bufor o wysokiej zawartości soli, wysoka temperatura 70°C itp.). Ponadto aktywność proteinazy K nie jest hamowana przez SDS, mocznik, EDTA, chlorowodorek guanidyny, izotiocyjanian guanidyny itp., a pewna ilość detergentu może również zwiększyć aktywność proteinazy K. W leczeniu medycznym (dezynfekcja wirusów i drobnoustrojów), żywności (zmiękczanie mięsa), skórze (zmiękczanie sierści), winiarstwie (klarowanie alkoholu), przygotowywaniu aminokwasów (zdegradowane pióra), ekstrakcji kwasów nukleinowych, hybrydyzacji in situ itp. proteinaza K ma zastosowania. Najczęściej stosowanym zastosowaniem jest ekstrakcja kwasów nukleinowych.
Proteinaza K może enzymatyzować wszelkiego rodzaju białka w próbce, w tym histony ściśle związane z kwasami nukleinowymi, dzięki czemu kwasy nukleinowe mogą zostać uwolnione z próbki i wprowadzone do ekstraktu, co ułatwia kolejny etap ekstrakcji i oczyszczania. W procesie wykrywania wirusowego kwasu nukleinowego proteinaza K jest jednym z ważnych składników roztworu do pobierania próbek wirusa. Proteinaza K może rozbić i inaktywować białko otoczki wirusa, co zwiększa bezpieczeństwo na etapie transportu i wykrywania; ponadto proteinaza K może również degradować rybonukleazę, zapobiegając degradacji wirusowego RNA i ułatwiając wykrywanie kwasów nukleinowych.
Nocna sława proteinazy K
Zarówno w badaniach naukowych, jak i w dziedzinie diagnostyki in vitro, ekstrakcja kwasów nukleinowych jest najbardziej podstawowym eksperymentem, dlatego proteinaza K zawsze odgrywała bardzo ważną rolę. Jednak w przeszłości proteinaza K była znacznie mniej znana niż jej rola. W dużej mierze wynikało to z bardzo stabilnej relacji podaży i popytu na proteinazę K. Mało kto przypuszczałby, że podaż proteinazy K będzie stanowić problem.
Wraz z wybuchem nowej epidemii koronawirusa, zapotrzebowanie na testy kwasów nukleinowych gwałtownie wzrosło. Do końca czerwca 2020 r. Chiny wykonały prawie 90 milionów nowych testów koronowych, a liczba ta jest jeszcze bardziej alarmująca w skali globalnej. W eksperymentach z ekstrakcją kwasów nukleinowych, robocze stężenie proteinazy K wynosi około 50-200 μg/ml. Zazwyczaj do ekstrakcji próbki kwasu nukleinowego potrzeba około 100 μg proteinazy K. W praktyce, w celu zwiększenia wydajności ekstrakcji kwasów nukleinowych, często stosuje się zwiększoną ilość proteinazy K. Wykrycie kwasu nukleinowego nowego koronawirusa spowodowało duże zapotrzebowanie na proteinazę K. Pierwotna równowaga podaży i popytu na proteinazę K została szybko zerwana, a proteinaza K stała się ważnym materiałem zapobiegającym epidemii z dnia na dzień.
Trudności w produkcji proteinazy K
Chociaż wraz z rozwojem epidemii, ludzie docenili istotną wartość proteinazy K, to jednak żenujące jest to, że z powodu zbyt małego zainteresowania proteinazą K, niewiele krajowych firm zaangażowało się w jej produkcję. Kiedy ludzie chcieli rozpocząć produkcję proteinazy K, w trakcie procesu produkcyjnego odkryto, że proteinaza K jest wyjątkowo specyficznym białkiem. Zwiększenie zdolności produkcyjnych proteinazy K w krótkim czasie jest niezwykle trudne.
Produkcja proteinazy K na dużą skalę napotyka na następujące trudności
1. Niska ekspresja
Proteinaza K może niespecyficznie degradować większość białek i powodować poważną toksyczność dla komórek gospodarza, w których zachodzi ekspresja proteinazy K. W związku z tym poziom ekspresji proteinazy K jest zazwyczaj bardzo niski. Badania przesiewowe systemów ekspresyjnych i szczepów o wysokiej ekspresji proteinazy K zazwyczaj wymagają dłuższego cyklu.
2. Pozostałości pigmentów i kwasów nukleinowych
Fermentacja na dużą skalę wprowadza dużą ilość pigmentu i reszt kwasu nukleinowego gospodarza. Trudno jest usunąć te zanieczyszczenia za pomocą prostego procesu oczyszczania, a złożone oczyszczanie zwiększa koszty i zmniejsza wskaźnik odzysku.
3. Niestabilność
Proteinaza K nie jest wystarczająco stabilna, może sama siebie enzymatyzować, a ponadto trudno jest przechowywać ją stabilnie w temperaturze 37°C przez dłuższy czas bez środka ochronnego.
4. Łatwo wytrąca się
Podczas przygotowywania liofilizowanego proszku proteinazy K, w celu zapewnienia dużej zawartości stałej proteinazy K w liofilizowanym proszku, konieczne jest dodanie liofilizowanego środka ochronnego o wysokim stężeniu, ale gdy stężenie proteinazy K osiągnie 20 mg/ml i więcej, łatwo jest Agregacja tworzy osad, który znacznie utrudnia liofilizację proteinazy K o dużej zawartości stałej.
5. Duża inwestycja
Proteinaza K wykazuje silną aktywność proteazową i może hydrolizować inne proteazy w laboratorium. Dlatego proteinaza K wymaga specjalistycznych obszarów produkcyjnych, sprzętu i personelu do badań, rozwoju i produkcji.
Roztwór proteinazy K firmy XD BIOCHEM
XD BIOCHEM dysponuje dojrzałą platformą do ekspresji i oczyszczania białek oraz bogatym doświadczeniem w ekspresji i oczyszczaniu białek rekombinowanych oraz optymalizacji procesów produkcyjnych. Dzięki szybkiemu utworzeniu zespołu badawczo-rozwojowego, udało się pokonać trudności związane z procesem produkcji proteinazy K na dużą skalę. Miesięczna produkcja liofilizowanego proszku przekracza 30 kg. Produkt charakteryzuje się stabilną wydajnością, wysoką aktywnością enzymatyczną i brakiem reszt cytochromu i kwasu nukleinowego gospodarza. Zapraszamy do kontaktu z XD BIOCHEM. Zamów pakiet próbny (e-mail:sales@xdbiochem.comTel.: +86 513 81163739).
Rozwiązania techniczne XD BIOCHEM obejmują
Wykorzystując integrację plazmidu wielokopijowego, wybiera się szczepy o wysokiej ekspresji, wynoszącej 8 g/l, co rozwiązuje problem niskiego poziomu ekspresji proteinazy K.
Dzięki zastosowaniu wieloetapowego procesu oczyszczania udało się skutecznie usunąć pozostałości cytochromu gospodarza i kwasu nukleinowego proteinazy K w ilościach poniżej wartości standardowej.
Poprzez wysokoprzepustowe badanie formulacji buforów ochronnych wybrano bufor, który może stabilnie przechowywać proteinazę K w temperaturze 37°C.
Bufory przesiewowe rozwiązują problem łatwej agregacji i wytrącania się proteinazy K w wysokich stężeniach, a także stanowią podstawę liofilizacji o wysokiej zawartości substancji stałych.
Próbka proteinazy K XD BIOCHEM
Test stabilności proteinazy K XD BIOCHEM: po 80 dniach w temperaturze pokojowej nie będzie znaczącej zmiany aktywności
Test stabilności proteinazy K XD BIOCHEM: nie będzie znaczących zmian w aktywności po 80 dniach w temperaturze pokojowej.
Porównanie efektu ekstrakcji kwasów nukleinowych przez proteinazę K XD BIOCHEM i produkty konkurencyjne. W procesie ekstrakcji kwasów nukleinowych wykorzystuje się odpowiednio XD BIOCHEM i kompetycyjną proteinazę K. Wydajność ekstrakcji proteinazy K XD BIOCHEM jest wyższa, a wartość Ct genu docelowego jest niższa.
Czas publikacji: 31 grudnia 2021 r.