IPTG (izopropylo-β-D-tiogalaktozyd) jest analogiem substratu β-galaktozydazy, który charakteryzuje się wysoką indukcją. Pod wpływem indukcji IPTG induktor może utworzyć kompleks z białkiem represora, co powoduje zmianę konformacji białka represora, uniemożliwiając jego połączenie z genem docelowym, a gen docelowy ulega wydajnej ekspresji. Jak zatem należy określić stężenie IPTG w trakcie eksperymentu? Czy im większe, tym lepsze?
Najpierw zrozummy zasadę indukcji IPTG: Operon laktozowy (element) E. coli zawiera trzy geny strukturalne, Z, Y i A, które kodują odpowiednio β-galaktozydazę, permeazę i acetylotransferazę. Gen lacZ hydrolizuje laktozę do glukozy i galaktozy lub do allolaktozy; lacY umożliwia laktozie z otoczenia przedostanie się przez błonę komórkową i wniknięcie do komórki; lacA przenosi grupę acetylową z acetylo-CoA do β-galaktozydu, co wiąże się z usunięciem efektu toksycznego. Ponadto istnieje sekwencja operacyjna O, sekwencja startowa P oraz gen regulatorowy I. Kod genu I jest białkiem represorowym, które może wiązać się z pozycją O sekwencji operatora, powodując represję i wyłączenie operonu (meta). Istnieje również miejsce wiązania białka katabolicznego aktywatora genu – miejsce wiązania CAP, położone przed sekwencją inicjującą P. Sekwencja P, sekwencja O oraz miejsce wiązania CAP razem tworzą region regulacyjny operonu lac. Geny kodujące te trzy enzymy są regulowane przez ten sam region regulacyjny, co zapewnia skoordynowaną ekspresję produktów genowych.
W przypadku braku laktozy operon lac (meta) znajduje się w stanie represji. W tym czasie represor lac wyrażany przez sekwencję I pod kontrolą sekwencji promotora PI wiąże się z sekwencją O, co zapobiega wiązaniu się polimerazy RNA z sekwencją P i hamuje inicjację transkrypcji; gdy obecna jest laktoza, operon lac (meta) może zostać zaindukowany W tym systemie operonu (meta) prawdziwym induktorem nie jest sama laktoza. Laktoza wnika do komórki i jest katalizowana przez β-galaktozydazę, aby zostać przekształcona w allolaktozę. Ta ostatnia, jako cząsteczka induktora, wiąże się z białkiem represora i zmienia konformację białka, co prowadzi do dysocjacji białka represora od sekwencji O i transkrypcji. Izopropylotiogalaktozyd (IPTG) ma takie samo działanie jak allolaktoza. Jest to bardzo silny induktor, który nie jest metabolizowany przez bakterie i jest bardzo stabilny, dlatego jest szeroko stosowany w laboratoriach.
Jak określić optymalne stężenie IPTG? Weźmy za przykład E. coli.
Genetycznie zmodyfikowany szczep E. coli BL21 zawierający dodatni rekombinowany pGEX (CGRP/msCT) zaszczepiono do płynnego podłoża LB o stężeniu 50 μg·ml-1 Amp i hodowano przez noc w temperaturze 37°C. Powyższą hodowlę zaszczepiono do 10 butelek o pojemności 50 ml świeżego płynnego podłoża LB o stężeniu 50 μg·ml-1 Amp w stosunku 1:100 do hodowli ekspansyjnej. Gdy wartość OD600 wynosiła 0,6–0,8, do końcowego stężenia dodano IPTG. Stężenie to wynosiło 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·l-1. Po indukcji w tej samej temperaturze i tym samym czasie pobrano 1 ml roztworu bakteryjnego, a następnie zebrano komórki bakteryjne przez wirowanie i poddano elektroforezie SDS-PAGE w celu przeanalizowania wpływu różnych stężeń IPTG na ekspresję białka, a następnie wybrania stężenia IPTG o największej ekspresji białka.
Po przeprowadzeniu eksperymentów okaże się, że stężenie IPTG nie jest tak wysokie, jak to możliwe. Wynika to z pewnej toksyczności IPTG dla bakterii. Przekroczenie tego stężenia również spowoduje śmierć komórki; ogólnie rzecz biorąc, mamy nadzieję, że im więcej rozpuszczalnego białka jest obecne w komórce, tym lepiej, ale w wielu przypadkach, gdy stężenie IPTG jest zbyt wysokie, powstaje duża ilość inkluzji. W organizmie, ale ilość rozpuszczalnego białka zmniejsza się. Dlatego najbardziej odpowiednie stężenie IPTG często nie jest tym lepsze, co wyższe, ale tym niższe.
Celem indukcji i hodowli szczepów modyfikowanych genetycznie jest zwiększenie wydajności białka docelowego i obniżenie kosztów. Na ekspresję genu docelowego wpływają nie tylko czynniki własne szczepu i plazmid ekspresyjny, ale także inne warunki zewnętrzne, takie jak stężenie induktora, temperatura i czas indukcji. Dlatego, przed ekspresją i oczyszczeniem nieznanego białka, najlepiej zbadać czas indukcji, temperaturę i stężenie IPTG, aby dobrać odpowiednie warunki i uzyskać najlepsze wyniki eksperymentalne.
Czas publikacji: 31 grudnia 2021 r.