IPTG (izopropylo-β-D-tiogalaktozyd) jest analogiem substratu β-galaktozydazy, który jest wysoce indukowalny.Pod wpływem indukcji IPTG induktor może utworzyć kompleks z białkiem represorowym, w wyniku czego konformacja białka represorowego ulega zmianie tak, że nie można go połączyć z genem docelowym, a gen docelowy ulega skutecznej ekspresji.Jak zatem w trakcie eksperymentu określić stężenie IPTG?Czy im większy, tym lepszy?
Najpierw zrozummy zasadę indukcji IPTG: operon laktozowy (pierwiastek) E. coli zawiera trzy geny strukturalne, Z, Y i A, które kodują odpowiednio β-galaktozydazę, permeazę i acetylotransferazę.lacZ hydrolizuje laktozę do glukozy i galaktozy lub do allo-laktozy;lacY umożliwia laktozie znajdującej się w środowisku przejście przez błonę komórkową i przedostanie się do komórki;lacA przenosi grupę acetylową z acetylo-CoA do β-galaktozydu, co wiąże się z usunięciem efektu toksycznego.Ponadto istnieje sekwencja operacyjna O, sekwencja początkowa P i gen regulatorowy I. Kod genu I jest białkiem represorowym, które może wiązać się z pozycją O sekwencji operatorowej, tak że operon (meta) ulega represji i wyłączony.Istnieje także miejsce wiązania katabolicznego białka aktywatora genu-miejsca wiązania CAP powyżej sekwencji inicjującej P. Sekwencja P, sekwencja O i miejsce wiązania CAP razem tworzą region regulatorowy operonu lac.Geny kodujące trzy enzymy są regulowane przez ten sam region regulatorowy, aby osiągnąć skoordynowaną ekspresję produktów genów.
W przypadku braku laktozy operon lac (meta) znajduje się w stanie wyparcia.W tym czasie represor lac wyrażany przez sekwencję I pod kontrolą sekwencji promotora PI wiąże się z sekwencją O, co zapobiega wiązaniu się polimerazy RNA z sekwencją P i hamuje inicjację transkrypcji;gdy obecna jest laktoza, można indukować operon lac (meta). W tym systemie operonu (meta) prawdziwym induktorem nie jest sama laktoza.Laktoza wchodzi do komórki i jest katalizowana przez β-galaktozydazę i przekształcana w allolaktozę.Ta ostatnia, jako cząsteczka induktorowa, wiąże się z białkiem represorowym i zmienia konformację białka, co prowadzi do dysocjacji białka represorowego od sekwencji O i transkrypcji.Izopropylotiogalaktozyd (IPTG) ma takie samo działanie jak allolaktoza.Jest to bardzo silny induktor, który nie jest metabolizowany przez bakterie i jest bardzo stabilny, dlatego jest szeroko stosowany w laboratoriach.
Jak określić optymalne stężenie IPTG?Weźmy jako przykład E. coli.
Genetycznie zmodyfikowany szczep E. coli BL21 zawierający dodatni rekombinowany pGEX (CGRP/msCT) zaszczepiono do płynnej pożywki LB zawierającej 50 µg·mL-1 Amp i hodowano przez noc w temperaturze 37°C.Powyższą hodowlę zaszczepiono do 10 butelek 50 ml świeżej płynnej pożywki LB zawierającej 50 µg·mL-1 Amp w stosunku 1:100 dla hodowli ekspansyjnej i gdy wartość OD600 wynosiła 0,6 ~ 0,8, dodano IPTG do końcowego stężenia.Jest to 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·L-1.Po indukcji w tej samej temperaturze i w tym samym czasie pobrano z niego 1 ml roztworu bakteryjnego, komórki bakteryjne zebrano przez odwirowanie i poddano SDS-PAGE w celu analizy wpływu różnych stężeń IPTG na ekspresję białka, a następnie wybierz stężenie IPTG z największą ekspresją białka.
Po eksperymentach okaże się, że stężenie IPTG nie jest tak duże, jak to możliwe.Dzieje się tak dlatego, że IPTG ma pewną toksyczność dla bakterii.Przekroczenie stężenia również zabije komórkę;i ogólnie rzecz biorąc, mamy nadzieję, że im bardziej rozpuszczalne białko ulega ekspresji w komórce, tym lepiej, ale w wielu przypadkach, gdy stężenie IPTG jest zbyt wysokie, powstanie duża ilość inkluzji.Organizm, ale ilość rozpuszczalnego białka uległa zmniejszeniu.Dlatego też najbardziej odpowiednie stężenie IPTG często nie jest tym większe, tym lepsze, ale im niższe stężenie.
Celem indukcji i hodowli genetycznie zmodyfikowanych szczepów jest zwiększenie wydajności docelowego białka i zmniejszenie kosztów.Na ekspresję docelowego genu wpływają nie tylko czynniki własne szczepu i plazmid ekspresyjny, ale także inne warunki zewnętrzne, takie jak stężenie induktora, temperatura indukcji i czas indukcji.Dlatego też, ogólnie rzecz biorąc, zanim nieznane białko zostanie poddane ekspresji i oczyszczone, najlepiej jest zbadać czas indukcji, temperaturę i stężenie IPTG, aby wybrać odpowiednie warunki i uzyskać najlepsze wyniki eksperymentalne.
Czas publikacji: 31 grudnia 2021 r