Ditiotreitol (DTT) to powszechnie stosowany środek redukujący, znany również jako nowy zielony dodatek.Jest drobnocząsteczkowym związkiem organicznym posiadającym dwie grupy merkaptanowe (-SH).Ze względu na swoje właściwości redukujące i stabilność, DTT jest szeroko stosowany w eksperymentach biochemicznych i biologii molekularnej.
Główną rolą DTT jest redukcja wiązań dwusiarczkowych w białkach i innych biomolekułach.Wiązanie dwusiarczkowe jest ważną częścią zwijania i stabilności białek, ale w pewnych warunkach eksperymentalnych, takich jak redukcja redukcji SDS-PAGE, rekombinacja i zwijanie białek, konieczna jest redukcja wiązania dwusiarczkowego do dwóch grup tiolowych, aby rozwikłać strukturę przestrzenną białka białko.DTT może reagować z wiązaniami dwusiarczkowymi, redukując je do grup merkaptanowych, otwierając w ten sposób przestrzenną strukturę białka i ułatwiając jego analizę i manipulację.
DTT można również stosować do ochrony aktywności i stabilności enzymu.W niektórych reakcjach katalizowanych enzymatycznie aktywność enzymu może zostać zmniejszona przez utleniacz.DTT może reagować z utleniaczami, redukując je do nieszkodliwych substancji, chroniąc w ten sposób aktywność i stabilność enzymu.
W porównaniu do tradycyjnych środków redukujących, takich jak β-merkaptoetanol (β-ME), DTT jest uważany za bezpieczniejszy i bardziej stabilny środek redukujący.Jest nie tylko stabilny w roztworze wodnym, ale także zachowuje swoje właściwości redukujące w wysokiej temperaturze i warunkach kwasowo-zasadowych.
Korzystanie z NTC jest stosunkowo proste.Ogólnie rzecz biorąc, DTT rozpuszcza się w odpowiednim buforze, a następnie dodaje do układu doświadczalnego.Optymalne stężenie DTT należy określić na podstawie konkretnego eksperymentu i zwykle stosuje się je w zakresie 0,1–1 mM.Niższe stężenia mogą zmniejszyć niekorzystny wpływ na wzrost komórek i mogą zmniejszyć cytotoksyczność z powodu nadekspresji białek docelowych.Wyższe stężenia mogą powodować nadmierne obciążenie metaboliczne komórek, wpływając na wzrost komórek i wydajność ekspresji.
Sposobem na określenie optymalnego stężenia może być ocena poziomu ekspresji docelowego białka poprzez przeprowadzenie testów indukcji IPTG przy różnych stężeniach.Testy hodowli na małą skalę można przeprowadzić przy użyciu zakresu stężeń IPTG (np. 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM itd.), a efekt ekspresji przy różnych stężeniach można ocenić poprzez wykrywanie poziomu ekspresji docelowego białka (np. Western blot lub detekcja fluorescencji).Zgodnie z wynikami eksperymentów, jako stężenie optymalne wybrano stężenie zapewniające najlepszy efekt ekspresji.
Ponadto można także skorzystać z odpowiedniej literatury lub doświadczeń innych laboratoriów, aby zrozumieć powszechnie stosowany zakres stężeń IPTG w podobnych warunkach eksperymentalnych, a następnie zoptymalizować i dostosować zgodnie z potrzebami eksperymentalnymi.
Należy zauważyć, że optymalne stężenie może się różnić w zależności od różnych systemów ekspresyjnych, białek docelowych i warunków eksperymentalnych, dlatego optymalizację najlepiej jest przeprowadzać indywidualnie dla każdego przypadku.
Podsumowując, DTT jest powszechnie stosowanym środkiem redukującym, który można stosować do redukcji wiązań dwusiarczkowych w białkach i innych biocząsteczkach oraz do ochrony aktywności i stabilności enzymów.Jest szeroko stosowany w eksperymentach biochemicznych i biologii molekularnej.
Czas publikacji: 28 września 2023 r